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            幾種蛋白質(zhì)含量測量方法比較

            更新時間:2010-08-31      點擊次數(shù):3568

             

            幾種蛋白質(zhì)含量測量方法比較
            蛋白質(zhì)含量測定一直是生物化學(xué)中zui常用、zui基本的分析方法之一。蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ),沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。機體每個系統(tǒng)都有蛋白質(zhì)的參與,蛋白質(zhì)占人體重量的16.3%。人體的蛋白質(zhì)主要來源于食物:豆制品、肉類或者奶粉等副食品。既然蛋白質(zhì)都來自于食物,那么測定食物中的蛋白質(zhì)含量就變得很有必要。
            蛋白質(zhì)含量測定有好多種方法,歸納起來為:凱氏定氮法、雙縮尿法、Folin酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍法。不同的方法,原理、步驟和實驗試劑都各不相同,但是一直以來,凱氏定氮法zui為經(jīng)典,使用。近幾年,根據(jù)蛋白質(zhì)測定的凱氏定氮法,很多廠家已研制出了相應(yīng)的儀器,如:蛋白質(zhì)測定儀。蛋白質(zhì)測定儀測出的蛋白質(zhì)含量,包括其他非蛋白含氮化合物,如游離氨基酸、尿素等物質(zhì),因此該儀器有時又被叫做粗蛋白測定儀
            下面我們列表來對各種蛋白質(zhì)含量測定方法進行比較。

            方法
            靈敏度
            時間
            原理
            干擾物質(zhì)
            說明
            凱氏定氮法
            靈敏度低,使用于0.2-1.0mg氮,誤差為±2%
            費時,8-10小時,但如果采用凱氏定氮儀,縮短時間至4個小時
            將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨氣,然后用酸吸收滴定
            非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離)
            用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定,干擾少,如果采用凱氏定氮儀,就會大大縮短定氮時間
            雙縮尿法
            靈敏度低,1-20mg
            中速20-30分鐘
            多肽鍵+堿性Cu2+紫色絡(luò)合物
            硫酸銨:Tris緩沖液,某些氨基酸
            用于快速測定,但不靈敏,不同蛋白質(zhì)顯色相似
            Folin酚試劑法
            靈敏度高,<5微克
            慢速40-60分鐘
            雙縮尿反應(yīng),磷鉬酸-磷鎢酸試劑被TyrPhe還原
            硫酸銨,Tris緩沖液,甘氨酸,各種硫醇
            耗費時間長;操作要嚴格計時;顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化
            紫外吸收法
            較為靈敏,50-100微克
            快速5-10分鐘
            蛋白質(zhì)中的絡(luò)氨酸和色氨酸殘基在280nm處德光吸收
            各種嘌呤和各種核苷酸
            用于層析柱流出液的檢測,核酸的吸收可以校正
            考馬斯亮藍法
            靈敏度zui高,1-5微克
            快速5-15分鐘
            考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時,其λmax465nm變?yōu)?/span>595nm
            強堿性緩沖液,TritonX-100SDS
            的方法,干擾物質(zhì)少,顏色穩(wěn)定,顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

            由上表可知,考馬斯亮藍法和Folin酚試劑法靈敏度zui高,比紫外吸收方法高10-20倍。凱氏定氮法雖然比較復(fù)雜,但是度較高,因此作物蛋白質(zhì)測定的標準方法,而蛋白質(zhì)測定儀的發(fā)明,更是推動了凱氏定氮法的發(fā)展。我們在選擇何種方法測定蛋白質(zhì)含量時,應(yīng)該根據(jù)實際情況,從下面幾個點考慮:1.實驗堆測定所要求的靈敏度和度。2.蛋白質(zhì)的性質(zhì)3.溶液中存在的干擾物4.測定時間。從以上四個方面綜合考慮,zui后選擇zui合適的測定方法。
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